内容
在本文中：通过革兰氏染色鉴定细菌进行Ziehl-Neelsen染色测试研究细菌的行为和外观解释所有结果43参考文献
细菌的鉴定是一项复杂的任务。原因之一是，据估计，世界上有1万至10亿细菌！正确识别细菌非常重要，特别是在医学领域，对疾病的正确治疗在很大程度上取决于引起问题的微生物类型。在大多数情况下，识别是在消除的基础上进行的。要鉴定细菌，您必须执行染色测试，分析其外观并观察其对不同条件的良好反应。如果您需要快速的结果，请提取DNA样品以发送到实验室。
阶段
方法1：通过革兰氏染色鉴定细菌
- 确定 如果细菌是革兰氏阳性或阴性。 革兰氏染色是将细菌划分为两种最常见类型的方法：革兰氏阳性和革兰氏阴性。前者的细胞壁很厚，由一种叫做肽聚糖的聚合物组成，与革兰氏阴性细菌的薄壁一样，染色效果最好。
- 革兰氏阳性细菌的一些常见类型是链球菌，葡萄球菌，微球菌（或微球菌）和李斯特菌。
- 这是革兰氏阴性细菌的一些常见示例：奈瑟菌，不动杆菌，莫拉氏菌，肠杆菌科，弧菌，嗜血杆菌，梭菌和弯曲杆菌。
- 采取适当的防护措施。 测试期间将使用的细菌和化学元素会危害您的健康。进行染色测试时，请戴好安全护目镜，一次性丁腈手套和实验服。完成后，将手套和所有其他受污染的材料放在一个特殊的袋子里。切记要遵循实验室的程序，以除去被污染产品的包装袋。
- 将样品放在载玻片上观察。 要开始测试，请将一滴或细菌标本放在无菌载玻片上。然后，将刀片滑过3次点燃的本生灯，以固定样品，并在漂洗或添加试剂时防止其从平板中出来。
- 向刀片添加5滴紫色晶体。 将五滴结晶紫溶液倒在样品上。等待一分钟，使样品吸收结晶紫。
- 用晾衣夹将刀片固定到位，以免弄脏手。
- 彻底清洗刀片以去除污渍。 使用水龙头或挤压瓶，让水缓慢流淌长达五秒钟，以除去未粘附在样品上的墨水残留物。
- 将五滴革兰氏二极管染色剂倒在幻灯片上。 它是由二极管，碳酸氢钠和二碘化钾组成的溶液，可使结晶紫与细菌的细胞壁融化。将五滴溶液倒在样品上，静置一分钟。
- 用酒精或乳酸清洗样品。 酒精和橡皮筋是漂白剂，如果革兰氏阴性，将消除细菌细胞壁的染色。将几滴漂白剂倒在样品上，使其工作时间不超过三秒钟。之后，尝试用水轻轻冲洗五秒钟以去除这些漂白剂。
- 如果让漂白剂长时间工作，则可能会导致革兰氏阳性细菌染色消失，从而导致假阴性。
- 与番红花进行对比测试。 番红花是一种红色染料，与紫罗兰色形成鲜明对比，因此可以使细菌染上不受紫色染色影响的颜色。将约五滴番红花素倒在样品上，静置一分钟。之后，尝试用水轻轻冲洗五秒钟。
- 以1000倍的放大倍率可视化样品。 由于藏红素，细菌会变成革兰氏阳性的紫色或紫色，如果革兰氏阴性则是粉红色的细菌。
方法2进行Ziehl-Neelsen染色测试
- 使用此技术检测耐酸细菌。 这些物质包含大量的脂质，使其对革兰氏染色所用的染料更具抵抗力。耐酸细菌属于分枝杆菌属，其包括负责结核病的细菌（结核分枝杆菌）。要使耐酸细菌染色，必须使用一种称为碳酰紫红色的红色染料，该染料可抵抗酸性或硫酸溶液的冲洗。
- 采取适当的防护措施。 Ziehl-Neelsen染色过程中使用的化学和生物材料可能很危险。此外，您还需要使用热源，例如本生喷嘴，电加热器或酒精灯。请按照以下说明进行测试。
- 戴上护目镜，丁腈手套和实验服。
- 注意不要吸入染料和漂白剂中的蒸气，也不要让水滴溅到眼睛或皮肤上。保持容器在引擎盖下打开。
- 加热刀片时要非常小心。所使用的大多数化学物质都是易燃的。在载玻片或其他设备上可能还会有易燃物质的痕迹。
- 准备刀片。 通过圆周运动，将少量细菌样品均匀地分散在无菌载玻片的中心。您的样品应该占据大约10毫米乘20毫米。
- 干燥刀片。 将刀片放在干燥结构上，样品朝上。让其自然干燥30秒。请勿尝试用布擦干刀片。
- 加热固定样品。 使样品向上，将刀片在点燃的本生灯上滑动两到三遍。您还可以通过将温度设置在65°C和75°C之间至少两个小时，将刀片放在电加热器上。注意不要煮沸或燃烧样品。
- 将碳质品红添加到刀片中。 将几滴这种溶液倒在幻灯片上。倒入足以完全覆盖样品的液体。
- 加热刀片以固定染料。 将样品朝上，在本生灯或酒精灯上小心地加热载玻片，或将其放在电加热器上。将刀片加热到60°C或直到它开始释放蒸汽为止。让染料作用五分钟。
- 如果使用电加热器，请在60°C的温度下打开。如果您选择酒精灯或本生灯，您会期望看到烟雾。
- 为使刀片在所需温度下保持五分钟，请对其进行间歇加热。
- 注意不要煮沸，燃烧或干燥样品。
- 用冷水冲洗刀片。 让其冷却五分钟，然后用清水轻轻冲洗几秒钟。使用自来水或挤压瓶去除尚未附着在样品上的染料污渍。
- 倒入样品酸性酒精或硫酸。 使用体积为3％（体积/体积）的酒精或20％的硫酸完全覆盖样品。让酸起作用，直到颜色消失并达到非常明亮的粉红色阴影为止。该过程通常需要大约十分钟。
- 使用清水冲洗刀片。 在水龙头下或使用挤压瓶轻轻清洗刀片。清除所有酸和染料残留物。
- 添加造影剂。 冲洗载玻片后，倒在孔雀石绿或亚甲基蓝的染料上。这两种解决方案会产生蓝色或绿色背景，红色染料以及其他生物材料（例如人细胞和非耐酸细菌）将在其上出现。让这些物质工作一到两分钟。
- 冲洗并擦干刀片。 用水彻底冲洗以去除多余的对比度。完成后，用一块干布擦干刀片的背面，然后使其在架子上自然干燥。
- 以1000倍的放大倍率可视化样品。 耐酸细菌会变成红色或深粉红色。其他细菌，非细菌细胞和刀片的底部将变为绿色或蓝色。
方法3：研究细菌的行为和外观
- 分析细菌的形状。 在进行染色测试以确定细菌是革兰氏阳性，革兰氏阴性还是耐酸之后，是时候更精确地鉴定细菌了。首先，分析载玻片上细菌的形状。三种最常见的形式是球菌（球形），螺旋形和杆菌（棒状）。
- 这些形式有几种变体。例如，圆形细菌（球菌）可以成对出现（双球菌），成串出现，成堆出现或成组出现（四个）。
- 找出细菌是需氧的还是厌氧的。 取两个细菌样本，并创建两个单独的培养物。月亮必须是无氧的（无氧生长），而另一个必须是有氧的（无氧生长）。在观察到生长之前，将厌氧培养物在35°C的无氧环境中保存至少48小时。
- 如果细菌在没有氧气的环境中生长，但是在暴露于氧气的环境中却没有，则表明它们是厌氧的。
- 尽管它们在有氧环境中发育，但是在没有氧气的情况下却没有，但是它们是有氧的。
- 当它们在两种环境中生长时，我们谈论兼性厌氧细菌。
- 执行运动测试。 如果细菌可以与一个或多个鞭毛一起单独移动，则它是可移动的。在确定某些细菌种类时，运动度非常重要。运动有几种类型，但是最安全，最易读的方法是半固体培养基。
- 建立动力测试的文化。 在培养液中准备细菌培养物。请按照以下说明准备您选择的汤。
- 将培养物接种在半固体琼脂中以进行运动测试。 用无菌接种针包被一部分培养液。小心地将针头插入准备进行测试的半固态dagar管（例如TTC lagar）中。针头必须穿透琼脂的2/3。
- 完成后，小心地移出针头，注意不要超过接种区域的限制。
- 将试管在30°C下孵育48小时。
- 读取测试结果。 进行活力测试的琼脂在与细菌接触时会变红。如果它们是可移动的，则该红色或粉红色调会散布到整个物质中。否则，染色将仅限于注射部位。
方法4：解释所有结果
- 收集您的评论。 要了解细菌的种类，您将需要收集从培养物中获得的信息，着色测试和形态观察。如果您正在检查患者的样本，则它们出现的症状也可能有助于确定合适的细菌类型。
- 例如，如果测试表明细菌是革兰氏阴性，厌氧性，不运动的，并且您发现患者出现腹痛，恶心和呕吐等症状，则患者很可能患有拟杆菌病。脆弱。
- 咨询数据库。 世界上有数千种细菌。不可能完全了解所有事情。您可能需要查阅临床微生物学书籍或在线数据库，以将测试结果与细菌种类信息进行比较。
- 有许多出色的在线资源可用于识别细菌，但是大多数数据库都以英语提供，包括Patricbrc.org和GlobalRPh。但是，您仍然可以在INRA国际微生物资源中心网站上找到有用的信息。
- 做一次基因测试以了解细菌的确切种类。 在某些情况下，您可能需要识别细菌种类。最快，最简单的方法是执行DNA测试。 DNA测试也可用于鉴定对传统染色和培养形式具有抗性的细菌。如今，对微生物的DNA测试非常快速，并且可以在不到两个小时的时间内完成。
- 如果您无权进行对微生物进行基因测序的实验室，请将细菌样本发送到专门机构。